서 언
섬괴불나무(Lonicera insularis Nakai)는 낙엽성 관목으로 주로 해안가 산록에서 자생하며, 잎은 마주나기로 넓은 난형 또는 타원형으로 주로 약용으로 쓰인다. 꽃은 5월 중순부터 6월까지 백색으로 개화 후 황색으로 지고, 여름철에 성숙하면서 붉게 착색되는 둥근 과실은 관상적 가치가 높아(NKISBS 2024), 정원 및 공원에 조경수로 식재하기 적합한 관상식물이 다. 또한 꽃에는 다량의 꿀이 존재하여 밀원식물로써의 활용도 로 적합한 고품질 유용자원식물이라고 할 수 있다. 과거부터 꽃이나 잎, 줄기를 이용해 암 치료나 해열 및 해독을 위해 민간요 법으로 사용되어 왔으며, 특히 인동과(Caprifoliaceae) 식물에 함유되어 있는 대표적인 화학성분으로 iridoids, flavonoids, liganas 등이 보고되었다(Lee et al 2020). 동아시아 전통 한의 학에서 항산화나 염증 완화 등을 위해 가장 많이 사용되는 약재 중 하나로(Shang et al 2011), 현재 약 500여가지 이상의 질병 예방과 처방에 사용되고 있어(Liu et al 2015), 약용식물로써의 역할로도 잠재적 가치가 큰 식물이다. 인동속(Lonicera)은 전세계에 약 200여종이 분포하고 있다(Fang et al 2020;Jacobs et al 2009). 일본 약 25여종, 한국 약 30여종, 중국에 약 100여 종 등 주로 동아시아 지역을 중심으로 분포하는 것으로 알려져 있고(Kang et al 2018;Liu et al 2018), 그 중 섬괴불나무(L. insularis)는 울릉도에서만 제한적으로 자생하고 있는 우리나라 특산식물로 희귀수종이다(Chung et al 2023).
특산식물(endemic plants)은 전 지구적 분포 범위 측면에서 고유한 환경에 자연적으로 적응진화해온 한정된 식물을 일컬으며, 여러 환경요인으로 인한 개체군의 감소나 위협 등(Kim et al 2023;Thompson et al 2005;Aikens and Roach 2014) 생물다양성 변화에 직면한 생태적 지위를 가진 식물을 뜻한다. 이들은 지리적 및 환경적인 영향 등에서 비롯된 문제들로 고립 정도가 크기 때문에(Hamabata et al 2019;Cal et al 2023), 다양한 시간적 및 지리적 측면, 기후변화와 서식지 파괴 등에서 나타나는 뚜렷한 진화 단위를 나타내는 지표가 될 수 있음을 의미한다(Médail and Baumel 2018). 그렇기 때문에 해당 국 가나 지역에서만 자라는 특산식물의 절멸(Extinct, EX)은 곧 한반도 전체 혹은 범 지구적 수준에서 사라진다는 것과 같은 뜻과 같은 것으로 해석되고 있으며(Kim et al 2018a), 이러한 종의 보전과 지속적인 관리는 생물학적 보전의 핵심이 되는 문제로 인식되어 기초정보구축을 위한 연구의 중요성을 시사한다.
Kong(2002)에 의하면 한반도는 단위면적당 대비 여러 식물 상과 식생의 다양성이 풍부하다고 하였는데, 특히 사면이 모두 바다로 둘러싼 울릉도의 경우 화산폭팔 이후 수백만 년 세월의 흐름 속에 조성된 특유의 독립적인 자연생태환경을 갖고 있다 (Yang et al 2015). 울릉도에는 특산식물 31종, 자생지 희귀멸 종식물 46종 등 550여종의 자생식물이 있으며(Chung et al 2010;Choi et al 2014), 다른 섬들에 비해 자생지 대비 희귀식 물의 비율이 상대적으로 높다(Kim et al 2018b). 울릉도 특산 식물에 관한 연구로는 섬쥐똥나무종자의 휴면유형과 발아(Ko et al 2017), 울릉도 희귀, 특산식물 섬현호색의 유전적 다양성 과 구조(Kim et al 2006), 식물생장조절제가 추산쑥부쟁이 캘 러스와 신초 유도에 미치는 영향(Jeong et al 2023) 등이 있으 며, 울릉도에 자생하는 식물들의 현지내외 보존을 위한 여러 연구들이 보고되었다. 섬괴불나무에 관한 국내 연구로는 Park et al.(2019)의 인동덩굴속(Lonicera) 4종의 종자 휴면 및 발아의 생태생리학, Lee et al.(2020)의 섬괴불나무 잎 추출물의 생리활성, Yu(2022)의 섬괴불나무 추출물의 면역자극 및 항비만 활성 등의 연구가 보고된 바 있다. Lee et al.(2014)의 초록발표에서 섬괴불나무에 대한 삽목번식에 관한 연구가 이루어졌으나, 구체적인 정보가 부족하여 산업화를 위한 번식자료로 적용하기에는 어려움이 있는 실정이다. 울릉도 내에서만 서식하는 섬괴불나무의 종자확보의 경우에도 지리적인 어려움이 있으며, 태풍으로 인한 종자유실 및 비립종이 상당수 존재하기 때문에 안정적인 공급이 필요하다.
정원 및 원예용으로 적합한 새로운 관상식물, 고품질 경제수 종으로 상업적 이익을 실현하기 위해서는 번식 프로토콜이 마련 되어야하며, 이를 이행하기 위한 인공적인 증식방법이 제시되어 야한다. 현재까지 섬괴불나무에 관한 기초번식에 대한 연구는 미흡한 실정이며, 본 대상종은 한국 국가적색목록기준평가에 정보부족(DD)종으로 등록되어 있다(NKISBS 2024). 그렇기 때문에 본 연구에서는 관상 및 약용식물로써의 잠재적 가치 및 경제성 높은 유용자원식물의 대량번식을 위해 무성번식에 대한 방법을 제안하고자 한다. 무성번식은 단기간 내에 대량증식이 가능하고, 모주의 우수한 형질을 동일하게 유지할 수 있으며, 적은 면적에서 균일하게 생산할 수 있는 방법으로 많이 활용되 고 있다(Carter 1984;Tchoundjeu et al 2004). 단시간 내에 개체의 생산성을 개선하고 경제적인 방법을 적용하기위해 보편 적으로 실용화되고 있는 상업적 뿌리 촉진 화학 물질인 루톤분 말과 인공 합성 auxin인 IBA, NAA를 통한 연구들이 진행되고 있음에 따라(Blythe et al 2004;Shekhwat and Manokari 2016), 본 실험에서는 줄기삽목에 따른 다양한 농도의 식물생장 조절제(plant growth regulators, PGRs)를 이용하여 통한 최적의 옥신 농도를 제안하기 위한 실험이 수행되었다.
재료 및 방법
실험재료 및 조사항목
본 실험에 사용된 공시재료인 섬괴불나무(Lonicera insularis Nakai)는 국립수목원 유용식물증식센터 내 생육중인 개체에서 2023년 6월 15일에 삽수를 수집하였다. 모체에서 절단하는 과정에서 삽수의 오염을 방지하기 위하여 70% ethanol로 소독해 준 뒤, 알코올램프(Stainless-steel Alcohol Lamp)로 열처리 후 소독된 전정가위를 사용하였다. 삽수는 평균길이 5.84 ± 0.13cm (n=10)의 일정한 길이로 맞춘 뒤, 기부에 해당하는 부 위를 약 45°사선으로 절단하고, 절단 즉시 물에 침지해주었다. 또한 잎의 경우 증산작용을 억제하기 위하여, 1/2로 자른 잎 2매만 남겼다.
삽목상(Plug tray)의 규격은 40구(54×27×4.8cm)를 사용하였으며, 시험구는 완전 임의배치법(Completely randomized design)으로 배치하였다. 관수주기는 표면이 마르지 않도록 저면관수로 3일에 1회 간격으로 관수하였다. 실험환경은 일장이 16/8h(day/night)로 설정된 Phyto-tron system(Phyto-tron, Dooyoung, Yangju, Korea)에서 광원은 White LED(HT-400- White, ESLEDs, Seoul, Korea)를 사용해주었고, 온도와 습도, 광도가 각각 25 ± 3℃, 70 ± 5%, 215.8 ± 10μmol·m-2·s-1로 유지되었다.
생육특성조사는 발근율, 생존율, 캘러스형성율, 엽수, 측지수(no data), 측지 길이(no data), 근장, 근수, 뿌리생중량, 뿌리건중량, 뿌리형성의 해부학적 관찰을 진행하였고, 삽목 6주 후 기록하였다. 발근의 경우 2mm 이상 자란 뿌리를 기준으로 하였고, 근장은 뿌리길이 중 가장 긴 부위를 버니어캘리퍼스(Vernier calipers)로 측정하였으며, 생존율은 삽수 형태 및 생육의 변화가 진행된 것을 백분율로 산출하였다. 뿌리 생중량의 경우 조사 전까지 가능한 마르지 않도록 관리한 상태에서 측정 전 뿌리부위에 남은 수분과 흙을 닦아낸 후 즉시 측정하였으 며, 건중량은 Drying Oven(OF-02G, Jeio Tech Co. Ltd., Daejeon, Korea)에서 70℃로 72시간 건조된 시료의 무게를 조사하였다. 뿌리 형성의 해부학적 관찰을 위해 양면 면도날 (Stainless-ST-300 ANMO Electronics Co. Taiwan)을 사용하 여 절단하였으며, USB전자현미경(AM3111 Dino-Lite premier, ANMO Electronics Co., Taiwan)을 통해 내부형태를 촬영하 였다.
PGRs 종류 및 농도처리
섬괴불나무의 PGRs 처리에 따른 발근실험은 대조구의 경우 무처리구(distilled water), 상업용 발근촉진 중 하나인 Rootone (1-Naphthylacetamide 0.4%, Agrotech, Korea)처리, 100, 500, 1000, 2000mg･L-1 의 NAA(Napthalene acetic acid, MB Cell. Los Angeles, CA, USA)와, IBA(Indole acetic acid, Duchefa, Haarlem, Netherlands)로 처리하였다. 각 용액은 ethanol(99.9%)로 녹이고 증류수로 희석하여 제조하 였다. 절단된 섬괴불나무 삽수의 기부는 250mL의 100, 500, 1000mg･L-1 용액에 5분간 침지하고, 2000mg･L-1 의 처리구 에서는 10초간 순간침지를 실시하였다. 침지 직후의 삽수는 원 예용상토(Baroker, Seoul Bio, Eumseong, Korea)와 펄라이 트(Ecolite #3, Homan, Korea)를 50:50(v : v)으로 혼합하여 충진된 삽목상에 각 처리구별로 10개씩 3반복으로 꽂아 진행하 였다.
통계분석
발근특성 및 발근율 실험의 측정값을 분석하기 위해 각 처리 별로 조사된 데이터는 통계분석용 프로그램인 SAS 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA) 하였으며, p < 0.05 유의수준 내에서 Duncan’s multiple range test를 통해 2차 검증을 실시하였다. 그래프는 Sigma Plot 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 통해 제시하였다.
결과 및 고찰
뿌리는 식물체를 물리적으로 토양에 지지시켜주고, 물과 무기양분을 흡수하며, 탄수화물을 축적하는데 필요하기 때문에 (Song et al 2014), 초기 활착에 있어 매우 중요하다. 삽목 시 안정적인 발근을 위한 중요한 부분 중 하나로는 발근에 적합한 삽목용토를 제공하는 데에 있으며, 이후 식물의 생장에 적합하도록 토양 내 수분 및 통기의 균형이 필요하다(Osson and Kunene 2010;Hartmann et al 2002). 본 실험결과 섬괴불나 무의 줄기를 절단 후 식물생장조절제를 처리하였을 때의 종류별 및 농도별처리에 의한 생존율은 NAA 100mg･L-1을 제외한 모 든 처리구에서 55% 이상으로 나타났다(Fig. 1A). 생존율만 놓 고보았을 때 무처리구에서도 50% 이상이 생존하였는데, 실험당 시 사용한 원예용상토와 펄라이트를 혼용한 삽목용토가 적절한 삽상환경을 제공해준 것으로 판단된다. 이는 삽수가 절단 후 삽목상에서 생육될 때, 생육기간이나 습도조건이 계속됨에 따라 오염율이 높아 고사하는 경우가 많기 때문에(Gil et al 2020), 이러한 결과가 나온 것이라고 판단된다. 발근율에서는 무처리구 와 PGRs처리구간의 유의성을 보였는데, 무처리의 경우 13.3% 의 저조한 발근율을 나타낸 반면, Rootone에서 63.3%, IBA 100, 500, 1000, 2000mg･L-1 및 NAA 100, 500, 1000, 2000mg･L-1에서 각각 23.3, 50.0, 60.0, 56.6% 및 10.0, 53,3, 56.6, 67.0%로 상반된 결과값을 보였다(Fig. 1B). 특히 Rootone과 IBA 처리구(500, 1000, 2000mg･L-1), NAA 처리 구(500, 1000, 2000mg･L-1)에서 뿌리 발달에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단되었다. Comming(1976)은 상업 목적으로 사용되기 위한 묘목의 조건 중 하나로 적어도 50% 이상의 발근 율을 보여야 함을 제시한 바 있으며, 목본식물 Ficus religiosa의 무성번식 시 IBA 1000mg･L-1, NAA 500mg･L-1에 침지 시 효과적인 수단임을 보고하였다(Salmi and Hesami 2016). 또 한 Morus alba의 경우 IBA 3000mg･L-1에서 87%의 발근을 유도하여 대조군의 반응과 상당한 차이를 확인하였다(Husen et al 2015). 이러한 경향은 본 연구에서도 입증할 수 있었는데, 무처리구에 비해 PGRs 처리구들에서 동일하게 향상된 발근율 의 연구결과는 이전에 보고되었던 IBA 및 NAA 처리시 뿌리유 도 반응에 긍정적인 영향을 미치는데에 뒷받침해주는 자료라고 판단된다. 그러나 적용한 농도나 침지시간은 다르므로, 이에 따 른 삽수의 발근효과에 대한 조사는 추후 연구가 더 필요할 것으 로 사료된다. 근장은 Rootone과 NAA 2000mg･L-1에서 각 5.3cm, 5.0cm로 가장 길었으나, 무처리구는 4.0cm로 차이가 없어 길이 신장에는 영향을 미치지 않은 것으로 보인다(Fig. 2A). 근수는 무처리구에서 2개로 가장 적었고, IBA 1000mg･ L-1 서 15.7개로 가장 많은 뿌리 수가 생성되었다(Fig. 2B). 식물 은 필수 영양소를 더 원활히 흡수하기 위해 많은 수의 뿌리를 생성하려고 한다. PGRs는 영양번식을 할 경우 삽수에 영향을 미치는 또 다른 중요 요소이며, 여러 내인성 및 환경적 요인에 영향을 받는 부정근을 형성하는 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려진 바 있다. Auxin은 삽수 절단부위로 운반되어 세포수준 에서 기관수준에 이어 궁극적으로 식물 전체에 이르기까지 발달 을 조정하는데, 이는 절단 시 삽수의 상처조직에서 국소적으로 농도가 축적되고, 많은 유전자가 Auxin 수송에 관련하여 옥신 반응성(AXR)을 유발하기 때문에 세포 분열 및 신장과 관련된 성장 반응을 향상시키는데 영향을 미친다(Liu et al 2013;Yoon et al 2021;da Costa et al 2013;Ikeuchi et al 2016). 화목류의 삽목증식에서 합성 Auxin 처리에 의한 발근촉진효과 는 많이 제공되고 있으며(Kim et al 2016;Kim et al 2015;Son et al 2022), 식물생장조절제 의외에도 시기(Hwang et al 2015), 광도(Jeong et al 2017), 부위(Lee et al 2013) 등에 따른 연구들이 진행된 바 있다. 최적의 삽목번식을 위한 지표로 는 뿌리의 생육을 나타내는 근수, 근장, 지하부의 생체중 및 건 물중 등의 발달이 우수하여야 적정기준으로 선정할 수 있는데 (Oh and Lee 2022), 섬괴불나무의 해부학적 관찰결과 옥신의 활성에 의해 삽수 기저부에서 근원기(root primodia)가 분화 되어 목질로부터 생성된 뿌리원기를 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이는 PGRs가 관여하여 다당류 가수분해의 활성으로 인해 당 가용성을 증가시키게 되고, 궁극적으로 뿌리원기에 에너지를 제공하는 작용을 하였기 때문이라고 판단된다(Altman and Wareing 1975;Husen and Pal 2007). 뿌리생체중은 대조 구에서 26.7mg으로 가장 낮았고, Rootone 120.2mg, IBA 1000mg･L-1 133.1mg, NAA 2000mg･L-1에서 134.0mg으로 가장 높은 결과값을 보였다. 뿌리건물중 또한 대조구가 3.5mg으 로 가장 낮았고, Rootone 15.2mg, IBA 1000mg･L-1 17.6mg, NAA 2000mg･L-1에서 18.0mg으로 가장 높은 결과값을 나타 내어, 생체중의 무게변화 경향과 유사한 결과값을 확인할 수 있었다(Fig. 2C and 2D). 건중량은 각종 생리 대사 후 바이오매 스 축적의 최종 결과이며(Gu et al 2024), 해당 PGRs 조건들에 서 생산된 축적물은 섬괴불나무의 효율적인 지하부 생장을 의미 하는 것으로 판단된다. 캘러스 형성율은 대체적으로 20% 이상 형성되었고(Fig. 2E), 엽수의 경우 모든 처리구에서 2개 이하로 측정되었다(Fig. 2F). 캘러스의 형성은 식물조직의 상처를 재생 하는 여러 유전자의 조절을 포함하는 복잡한 과정이며, 손상과 관련된 스트레스에서 생존하기 위해 작용된다(Chang et al 2023). Song et al.(2019)은 캘러스 형성이 있는 경우 뿌리 유도를 지연시키거나 중단하여 품질이 낮아진다고 하였고, 반대 로 Eliyahu et al.(2020)은 Eucalyptus의 뿌리가 절단기부의 형성층 세포에서 캘러스에 의해 발생하기 때문에 캘러스 기작에 대한 중요성을 강조한 바 있다. 따라서 캘러스 형성으로 인한 대사경로가 삽수발근에 미치는 특성들은 차후 추가적인 실험에 서 고려해야 할 요소로 보인다. 앞선 재료 및 방법에서 조사항목 으로 명시한 측지 수와 측지 길이에 대한 데이터를 제시하지 않았는데, 조사 당시 새로 출현된 측지가 전혀 없었다(no data). 삽목 후 6주가 되는 시점에 생육조사를 실시하였는데, 이전의 PGRs를 처리한 지하부의 생육은 활발히 이루어진 반면 지상부 인 측지의 생육이 진행되지 않은 것으로 보아, 섬괴불나무의 삽목번식 시 측지가 생성되는 기간은 6주 이내에 출현하기까지 어려움이 있고, 이에 따라 그 이상의 기간이 소요될 것으로 판단 된다. 따라서 삽목을 통해 번식할 경우 기간에 따른 식물체 지상 부 생육이 지연될 수 있음을 시사하며, 실질적인 묘를 생산해야 할 경우 고려해야 할 사항이라고 생각된다.
본 실험결과를 종합적으로 살펴보면, 섬괴불나무의 줄기삽목에 있어 식물생장호르몬 종류 및 농도처리에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 발근율 및 근수, 생중량, 건중량의 생육지표들을 고려하였을 때, Rootone 분의처리 및 IBA, NAA의 1000mg･L-1와 2000mg･L-1이 최적의 농도라고 판단되었다. 이는 섬괴불나무가 경제적 및 상업적 수종으로써의 활용 가능성을 제시하고, 인공적인 대랑증식 시 적합한 번식체계를 확립하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.
