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Clematis patens Morr. & Decne.는 미나리아재비과 으아리 속에 속하는 다년생 숙근초로 꽃잎화한 꽃받침을 가지고 있는 점이 특징으로 커다란 꽃과 더불어 깃 같은 털이 달린 열매를 관상하는 식물이다. 대한민국, 중국, 일본, 북아메리카, 유럽 등 세계 각지에 야생종과 원종이 분포하고 있으며(Tamura and Shimizu 1982), 이들의 교잡에 의해서 많은 품종이 만들 어지고 있다. 화색, 개화기가 다양하여 화단, 분화, 절화 등 그 이용 범위가 넓으며, 대부분 덩굴성이지만 줄기가 곧게 서는 것도 있다. 꽃의 크기도 다양해서 작은 꽃은 5 ~ 6㎝ 큰 꽃은 10 ~ 15㎝ 이상 되는 것도 있으며, 화색은 흰색, 분홍색, 자주색, 보라색 등 다양한 화색이 존재하고 있다.
화색은 곤충이나 새를 불러들여 수분 매개자 역할을 하도록 하는 매우 중요한 요인이며, 화훼 육종에 있어서 중요한 목표 형질 중 하나이다. 화색의 대표적인 성분에는 flavonoid, carotenoid, betalain, chlorophyll이 있으며, 이 중 flavonoid는 식물의 2차 대사에서 중요한 구성 성분으로 식물의 모든 기관에 존재하면서 수분 매개자, UV에 대한 방어 기능, 병저항성, 스트레스저항성에도 관여하고 있다(Regan et al. 2001; Schaefer et al. 2004; Veeriah et al. 2006). Flavonoid의 생합성경로에 대해서는 Petunia hybida, Antirrhinum majus, Zea mays 등 다양한 종의 식물에서 보고되었으며(Holton and Cornish 1995; Winkel-Shirley 2001; Grotewold 2006), 관련 유전자들의 연구가 다양한 식물체에서 밝혀져 있다(Beld et al. 1989; Boss et al. 1996; Gerats and Martin 1992).
화색을 결정하는 요소는 다양하겠지만, 꽃잎 세포에서 합성되는 flavonoid로 총칭되는 식물의 이차 대사산물의 한 그룹인 anthocyanin의 종류가 색 결정에 중요한 역할을 한다. Anthocyanin은 anthocyanidin에 당이 결합한 배당체이며, anthocyanin의 색은 anthocyanin의 구조에 크게 의존하며 B환 수산기가 많을수록 청색을 띤다. B환 수산화는 flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H)와 flavonoid 3',5'-hydroxylase (F3'5'H)에 의해 촉매된다. F3'H와 F3'5'H의 활성이 없는 경우에는 pelagonidin이, F3'H의 활성이 있는 경우는 cyanidin이 F3'5'H의 활성이 있는 경우에는 delphinidin이 합성된다. pelagonidin을 포함한 꽃은 오렌지색, cyanidin을 포함한 꽃은 적색, delphinidin을 포함한 꽃은 푸른색을 띠는 경우가 많다(Forkman 1992).
이들 F3'5'H, F3'H 유전자는 Cytochrome P450의 CYP75A와 CYP75B의 각각의 그룹에 속하며(Dixon and Steel 1999; Holton 1995; Tanaka et al. 1998) 이들 유전자는 종자식물이 분화하기 전에 유전자 중복되었다고 추정하고 있다. 국화과 식물에는 delphinidin을 생산하지 않는 국화, 거베라, 다알리아와 같은 종과 delphinidin을 생산하는 과꽃, 시네라리아, 오스테오스페르뭄와 같은 종이 있다. delphinidin을 생산하는 과꽃, 시네라리아, 오스테오스페르뭄에서 분리된 F3 '5 'H 유전자는 CYP75A의 그룹이 아닌 CYP75B 그룹에 속해 있었다. 이 결과로부터 국화과의 선조 식물은 F3 '5 'H 유전자를 진화시키는 과정에서 그 기능을 잃었다가 일부 식물에서 F3 'H 유전자 중복을 통해 F3'5'H활성능력을 가진 유전자로 진화된 것으로 생각된다(Seitz et al. 2006).
클레마티스는 국화과 식물과도 식물계통학적으로 거리가 멀며, 같은 종내에 다양한 화색을 가지고 있어 delphinidin 계열 anthocyanin 색소 합성을 유도하는 F3'5'H의 다양한 화색별 발현패턴을 비교연구하기에 유용하다. 따라서 본 연구에서는 클레마티스에서 flavonoid 생합성 경로에 관여하는 유전자 중 delphinidin 계열 anthocyanin 색소 합성을 유도하는 F3'5'H를 동정하고 클레마티스 화색별 유전자의 발현 패턴을 비교분석, anthocyanin의 함량을 조사함으로써 클레마티스 화색과 flavonoid 생합성에 관여하는 유전자의 상관관계를 밝히고자 하였다.
재료 및 방법
식물재료
본 실험에서 사용된 클레마티스는 국내에서 수집된 클레마티스 유전자원 중 화색이 다르고 원예적 특성이 우수한 10품종을 대상으로 하였다(Fig. 1, Table 1). 농촌진흥청 국립원예 특작과학원 유리온실에서 재배하였으며 꽃잎을 발달단계에 따라 화피의 화색이 띠기 직전 단계(stage 1), 화색이 띠기 시작한 단계(stage 2), 꽃이 피기 직전 단계(stage 3), 완전 개화 단계(stage 4)로 4단계로 분류한 후 –80℃에 저장 후 Anthocyanin 분석 및 RNA 추출을 위한 재료로 사용하였다.
화색유전자 분리
Total RNA는 Clematis patens ‘The president’ 꽃잎에서 RNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였고, total RNA 추출액에 혼입된 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNase-Free DNase(Promega, USA)를 37℃ 1시간 처리하였다. gDNA를 제거한 total RNA와 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Japan)를 이용하여 매뉴얼의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다.
페튜니아, 금어초, 토레니아 등의 F3'5'H 유전자 염기서열을 기초로 제작한 degenerated primer와 Ex-taq을 이용하여 nested PCR을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 TA-cloning 및 sequencing 후 Blastn을 이용한 염기서열 확인을 거쳐 유전자 단편을 동정하였다.
아미노산 염기서열 비교와 유사도 분석 및 계통분석
본 연구에서 분리한 클레마티스의 F3'5'H 유전자의 염기서열 분석은 CLC bio 사의 CLC Main Workbench 프로그램을 이용하였으며, 다른 식물에서 분리되어 NCBI 유전자 은행 (Genbank)에 등록된 F3'5'H 유전자와의 아미노산 염기서열 상동성 검색은 Blastn 프로그램을 이용하였다. ClustalW를 이용하여 염기서열과 아미노산 서열을 비교 분석하였으며(Thompson et al. 1994), 이 결과를 바탕으로 neighbor-joining methods(Saitou and Nei 1987)를 이용하여 계통수 분석을 실시하였다.
화색관련유전자 발현양상 및 비교분석
클레마티스의 꽃을 각각 화피가 화색을 띠기 직전 단계(Stage 1), 화피가 화색을 띠기 시작한 단계(Stage 2), 꽃이 피기 직전 단계(Stage 3), 완전 개화 단계(Stage 4)로 나누어 RNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 추출액에 혼입된 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNase-Free DNase(Promega, USA)를 37℃에서 1시간 처리하였다. NanoVue(GE imagination at work)를 이용하여 260, 280nm 흡광도에서 농도를 측정하고 최종 RNA 농도를 500ng ․ μL-1로 정량하였다. PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Japan)를 이용하여 매뉴얼의 지시에 따라 1st cDNA를 합성하였으며, RT-PCR의 주형으로 사용하였다. 프라이머는 5'-GCTATGGCTAACATGATTGG-3' (forward) 5'-AGTGGTGTCGAAGGGTGTTT-3' (reverse)을 사용하였으며, PCR 조건은 첫 단계에서 94℃에서 5분간 pre-denaturation을 시킨 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 35cycle 반복하였고, 마지막 단계로 72℃에서 5분간 extension 하였다. 대조군은 actin을 사용하였다. 1% SeaKem® LE Agarose gel(Lonza, Rockland, USA)에서 전기영동하여 겔 형광 이미지 Redsafe (DYNEBIO)로 염색한 후 촬영하였다.
Anthocyanin 함량 분석
꽃잎으로부터 추출은 Tatsuzawa et al.(2006)의 방법을 사용하였다. 시료 각 100mg를 5% formic acid를 첨가한 DDW 20mL에 넣고 24시간 동안 침출한 뒤 whatman filter paper no. 2를 이용하여 여과, rotary evaporator를 이용하여 40℃에서 감압 농축 이후 –20℃에서 실험 전까지 보관하였다.
Total anthocyanin 함량 측정은 Guisti and Wrolstad(2001)의 방법을 사용하였다. 20mM potassium chlorid를 이용한 buffer(pH 1.0)와 400mM sodium acetate를 이용한 buffer(pH 4.5)에 각각의 시료를 넣고 15분간 반응한 뒤, 510, 700nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, 측정 결과를 이용하여 다음과 같은 식으로 흡광도(A) 값을 구하였다.
구해진 A 값으로부터, 다음과 같은 식을 통해 monomeric anthocyanin pigment(MAP) 함량을 구하였다.
위 식에서, MW 값은 cyanidin-3-glucoside의 분자량인 449.2이고, 흡광 계수인 값은 26,900이다. 구해진 total anthocyanin 함량은 cyanidin-3-glucoside 당량으로 나타내었다.
결과 및 고찰
화색 관련 유전자 분리 및 계통분석
본 실험에서 사용된 보라색 클레마티스 ‘The President’로부터 얻어진 단편 cDNA 염기서열은 약 1533bp였으며(data not shown), ClF3'5'H으로 명명하였다. PCR 산물의 염기서열을 BLAST 검색한 결과, 기존 보고된 Aconitum carmichaelii의 F3'5'H 유전자의 아미노산 서열(AEY80043)과 79% 일치하여 높은 상동성을 갖는 것을 확인하였다. 그 외의 다른 식물 종의 F3'5'H 유전자와도 71%에서 79%의 높은 상동성을 갖는 것을 확인하였으며, 고유한 기본 구조 단백질을 인코딩하는 Campanula medium F3'5'H(Okinaka et al. 2003)(BAA03440) 와는 63%의 상동성을 가졌다. 다른 식물에서 분리되어 Genbank 등록된 F3'5'H와 F3'H 유전자와의 계통적인 관계를 명확하게 하기 위하여 계통수를 작성한 결과, flavonoid의 생합성 및 화색을 제어하는 anthocyanin에 중요한 역할을 하는 식물 Cytochrome P450는 CYP75A와 CYP75B의 두 그룹으로 나뉘며(Tanaka and Brugliera 2013), delphinidin, cyanidin을 합성하기 위한 주요한 효소 유전자인 F3'5'H와 F3'H은 각각의 그룹에 속했다. 본 실험에서 분리한 ClF3'5'H는 CYP75A 그룹에 속하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
Flavonoid 생합성 관련된 유전자 발현 해석
화색이 다른 클레마티스 10품종 내에서의 ClF3'5'H 유전자의 발현을 조사하기 위해 꽃잎을 발달단계에 따라 화피의 화색이 띠기 직전 단계(stage 1), 화색이 띠기 시작한 단계(stage 2), 꽃이 피기 직전 단계(stage 3), 완전 개화 단계(stage 4)로 나누어 유전자 발현 분석을 실시하였다. 그 결과, 본 유전자를 분리한 클레마티스 품종인 ‘The President’에서는 stage 3에서도 stage 4와 같은 정도의 발현을 보였다. 보라색을 띠는 다른 클레마티스 품종 ‘Honora’에서도 stage 3 및 stage 4에서 발현이 확인되었다. ‘Yaich’에서는 stage 3 및 stage 4뿐 아니라 stage 2에서도 약한 발현을 보였다. 자주색을 띠는 클레마티스 품종 ‘Crimson King’, ‘Niobe’, ‘Warsaw Nike’에서는 보라색을 띠는 클레마티스 품종과 동일한 발현패턴을 보였다. 흰색을 띠는 클레마티스 품종 ‘Snow White’, ‘Sakura Hime’에서는 stage 1 ~ 3단계에서 검출되지 않았으며 ClF3'5'H 유전자의 발현이 많지는 않았으나 다른 발달 단계에 비해 stage 4에서 강하게 발현하였다. 분홍색을 띠는 클레마티스 품종 ‘Comtesse de Bouchaud’, ‘Hagley Hybrid’에서는 모든 발달 단계에서 ClF3'5'H 유전자의 발현이 검출되지 않았다(Fig. 3).
이러한 발현 현상은 Nielson and Podivinsky(1997)와 Noda et al.(2004)가 Lisianthus의 화색별로 flavonoid 생합성 관련 유전자의 발현량을 조사해본 결과, 흰색과 delphinidin이 축적돼 있는 보라색 꽃에서 Lisianthus의 F3'5'H 유전자의 발현이 검출된 반면, pelargonidin이 축적돼 있는 분홍색 꽃에서 발현이 검출되지 않았다는 결과와 일치하였다. 이 결과로부터 클 레마티스에서 분리한 ClF3'5'H 유전자가 클레마티스의 보라색 꽃 및 자주색 꽃에서 delphinidin 계열 anthocyanin 색소 합성에 관여하여 유전자가 발현했을 가능성이 시사되었다.
화색별 anthocyanin 함량
자주색을 띠는 ‘Crimson King’, ‘Niobe’, ‘Warsaw Nike’ 품종에서 많은 양의 monomeric anthocyanin이 검출되었으며, 흰색을 띠는 ‘Snow White’, ‘Sakura Hime’와 분홍색을 띠는 ‘Comtesse de Bouchaud’, ‘Hagley Hybrid’에서는 낮은 양의 monomeric anthocyanin이 검출되었다. 보라색을 띠는 ‘Honora’, ‘Yaich’, ‘The President’에서는 자주색의 클레마티스 품종에 비해서는 낮으나, 흰색과 분홍색을 띠는 품종에서보다는 높은 양의 monomeric anthocyanin이 검출되었다(Fig. 4). 총안토시아닌의 함량과 ClF3'5'H 유전자의 발현과의 상관관계는 없어 보였으나, Hasimoto et al.(2008)가 클레마티스 화색과 anthocyanin 및 플라보노이드에 관해서 조사한 결과, 흰색의 클레마티스에서는 Delphinidin과 Cyanidin는 검출되지 않았고, 분홍색 클레마티스에서는 소량의 Delphinidin과 Cyanidin이 검출되었으며, 보라색 클레마티스의 주된 색소는 Delphinidin이었다고 보고한 바 있으며, F3 '5 'H는 delphinidin 계열 anthocyanin 색소 합성을 유도하므로, C. patens 화색별 Delphinidin, Cyanidin, Pelargonidin의 함량 조사와 anthocyanin 생합성 관련 유전자의 발현 유무와의 상관관계에 관한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
Shimada et al.(1999)는 P. hybrida 와 E. grandiflorum에서 분리한 F3 '5 'H 유전자의 Nicotiana tabacum에서의 이형 발현과 Mori et al.(2004)은 Vinca major에서 분리한 F3'5'H 유전자의 Petunia에서의 이형 발현에 대해서 보고한 바 있다. 본 연구에서는 C. patens의 신규 F3'5'H 유전자를 분리 동정하였고, 생물학적, 생리학적 기능 해석을 위하여 모델식물에의 유전자 도입을 시도하고 있다. 이러한 연구결과들이 C. patens에서의 anthocyanin 생합성 조절에 관한 메커니즘을 이해하는데 뿐만 아니라 다른 식물체의 화색 조절에 관한 기작을 밝히는데도 도움을 줄 것으로 기대된다.
