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나리(Lilium spp.)는 국내 3대 절화로 2014년 현재 재배면적은 182ha, 생산액은 208억원이다(MIFAFF 2015). 일반적으로 나리는 구근의 자구, 인편, 줄기의 목자, 조직배양 등 영양 번식을 통해 증식하기 때문에 바이러스는 나리 재배에 있어 제한요소로 작용한다(Goo et al. 2013; Sharma et al. 2005). 일반적으로 나리에 가장 많이 나타나는 바이러스에는 Lily symptomless virus(LSV; genus Carlavirus), Lily mottle virus(LMoV; genus Potyvirus), Cucumber mosaic virus(CMV; genus Cucumovirus)가 있다(Park et al. 2003). 바이러스 주요 감염 증상으로는 모자이크, mottle, 줄무늬, 잎과 꽃의 기형, 식물체의 왜화, 생산성 감소 등이 있다(Lim et al. 2009).
Cucumber mosaic virus(CMV)는 genus Cucumovirus, family Bromoviridae에 속한다. Michigan and New York States에서 1916년에 처음 발견된 이래로, CMV는 세계에서 가장 흔한 바이러스로 약 800종의 식물을 기주로 이용되는 광범위 병원체로 경제적 영향력이 큰 바이러스이다(Kang et al. 2010). 나리에서 CMV는 농가 현장에서 LSV에 비하여 발생율이 낮은 편이나 절화 생산 시 생육이 감소하고 복합 감염 시 초장 및 생체중의 감소가 현저하게 나타났다(Chung et al. 2003; Kim et al. 2001). 구근 생산에 있어 바이러스는 부정적인 영향을 미치지만 여기에 대한 연구는 거의 이루어지 않았으며, 네덜란드에서 20% 이상의 수량이 감소하였다는 보고가 있었다(Asjes 2000).
바이러스 저항성 육종은 바이러스에 의한 농업 손실을 최소화할 수 있는 가장 효과적이면서 간편한 방법으로 여겨지나 바이러스 저항성 육종은 오랜 기간이 필요하고 고비용을 요구 하며 개발된 품종에 대해서는 저항성 특성이 지속되어야 한다(Kang et al. 2005). 이를 위해서는 병저항성 도입의 가치, 저항성 방어 기작의 선택, 저항성 유전자원의 확보, 검정방법 및 도입방법에 대한 전략이 필요하다(Kang et al. 2005). 최근 다양한 저항성 유전자가 보고되고 있으며 바이러스 식물 감염 메커니즘과 관련된 식물 저항성 기작과 관련 유전자들이 연구되어 발표되고 있다(Kang et al. 2005; Kang et al. 2010). 고추에서는 CMV에 저항성을 가지는 여러 품종이 개발되어 상용화 되고 있으며(Kang et al. 2010) 멜론의 경우 인위적으로 개발된 CMV 저항성 계통들은 조방적으로 재배됨에도 불구하고 저항성이 유지되고 있다는 보고가 있다(Lecoq et al. 2004).
본 연구는 나리에 있어 CMV 바이러스 저항성 육종을 위해 주요 모본과 부본으로 이용하는 우수 유전자원에 대해 바이러스 저항성 검정을 실시하여 바이러스 저항성 유전자원을 체계 적으로 선발하는데 목적이 있다. 접종 효율을 높이기 위한 방법 연구를 위해 버퍼의 pH 및 횟수에 따른 바이러스 감염 특성을 살펴보고 잎에 접종하였을 때 잎과 구근에서의 CMV 감 염여부를 확인하였다. 또한 CMV 감염과 관련된 유전자 중 나리에 있는 것으로 추측되는 유전자 중 선별한 3개 유전자를 중심으로 발현 분석을 실시하였다.
재료 및 방법
CMV 저항성 연구를 위해 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 나리 육종 시 주요 모본과 부본으로 이용하고 있는 아시아틱나리(‘Connecticut King’, ‘Mona’, ‘Prato’, ‘Dublin’, ‘Brunello’, ‘Rodrigo’), LA종간잡종나리(‘Party Diamond’, ‘FA08-17’), 오리엔탈나리(‘Casa Blanca’), OT종간잡종나리 (‘Avocado’) 10품종 을 실험재료로 이용하였다.
바이러스 저항성 평가를 위해 각 품종은 생장점 배양을 통한 조직배양을 실시하여 바이러스 무병 구근을 양성하였으며 양성된 구근은 2개월간 저온처리 후 2014년 7월 17일에 격리 상이 설치된 하우스에 32공 트레이를 이용하여 정식하였다. 생물검정을 위해 국립농업과학원에서 CMV 나리 분리주 CMV-Teaan을 분양 받았으며 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc)에 접종하여 모자이크 증상이 나타난 잎을 접종원으로 사용하였다. 2014년 8월 1일에 접종액은 감염 잎 1g에 5mL의 0.1M 인산완충액을 이용하였으며 접종효율 증진을 위해 KH2PO4 , Na2HPO4 를 이용하여 pH 6.9, 7.2, 7.5로 조정하여 접종하였으며 접종 횟수를 8월 1일과 6일에 2회로 나누어 접종하여 검정을 실시하였다. 접종원은 인산염 버퍼를 첨가 한 후 막자 사발로 담배 잎을 고르게 분쇄한 후 거즈 4겹으로 여과하여 준비하였으며 바이러스 접종을 위해 본엽이 출현한 후 Carborundum을 고르게 흩어 뿌린 후 면봉을 이용하여 잎 앞면과 뒷면에 문질러 접종을 실시하였다. 또한 조직배양구를 이용한 생물검정과 온실에 보유하고 있는 유전자원과의 바이러스 감염 특성을 비교하기 위해 국립원예특작과학원 유전자원 포장에 정식되어 있는 품종과 계통을 대상으로 각각 10 개체씩 샘플을 채취하여 감염 증상 조사와 바이러스 검정을 실시하였다.
접종한 개체의 CMV 감염 여부는 1차 접종 후 2주 후에 바이러스 감염 유무는 잎과 구근을 나누어 검정하였다. 조직배양구에 대한 접종의 경우 효소면역항체법(ELISA)과 Reverse transcription(RT)-PCR법을 이용하여 검정하였으며 포장 보유 품종은 RT-PCR법을 이용하여 판독하였다. ELISA의 경우, CMV용 상용 진단 키트(Agdia, phathoscreen kit, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였다. RT-PCR를 위하여 Total RNA를 Qiagen RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였으며 추출된 RNA 농도는 1㎕ 당 200ng으로 맞추어 역전사 반응을 위해 Primescript 1st strand cDNA synthesis kit(Takara, Shiga, Japan)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. CMV 바이러스 검정을 위해 Coat protein의 유전자 일부를 증폭할 수 있는 forward primer (5’- CGTCGTGGTTCCCGCTCCG -3’)와 reverse primer (5’- AGCGCGCATCGCCGAAAGAT -3’)를 제작하였으며 사이즈는 473bp(KT923118)였다. 발현비교를 위하여 18S rRNA의 forward primer(5’- GACGGAGAATTAGGGTTCGATT -3’)와 reverse primer(5’- CTCCACTCCTGGTGGTGCC -3’)를 제작하였으며 사이즈는 813bp(D29775.1)였다. PCR 반응을 위하여 cDNA 60ng, forward와 reverse primer 각각 10pM, Taq 1unit이 포함된 Emerald Amp GT PCR master mix(Takara, Shiga, Japan) 5μL를 추가하여 93℃에서 180초(denaturation), 58℃에서 30초(annealing), 72℃에서 30초(extension)의 조건으로 35 cycle 수행하였다. 중합효소연쇄반응 이후 1% agarose gel을 만들고 120V의 전압으로 25분간 전기영동을 실시하고 UV하에서 관찰하고 사진 촬영하였다.
바이러스 검정에 이용된 개체에 대하여 기존에 알려진 바이러스 저항성과 관련된 유전자가 존재하는지 확인하기 위하여 검토한 결과 3개 유전자 TOM1(forward primer; 5’- CGGTTGGACTACACAGAAGC -3’, reverse primer; 5’- ACAAAGCCAACCTCGTTCAGA -3’, 465bp; AT4G21790), OBE2(forward primer; 5’- GTGATTTGTGCTCGCACTGG -3’, reverse primer; 5’- CCTCTAACTCGCGCTCACAA -3’, 549bp; AT5G48160), DND1(forward primer; 5’- GCGTATGTGTCGAGGGAGTC -3’, reverse primer; 5’- GCCAGCTACATGAGATGCGAA -3’, 360bp; AT5G15410)를 선별하여 잎과 구근에서 발현을 비교하였다.
결과 및 고찰
나리의 경우 엽육이 두껍고 바이러스가 감염이 되어 있더라도 증상이 발현되지 않는 경우가 많다. 그러므로 접종을 성공하기 위해서는 적당한 버퍼 pH와 노력을 최소화 할 수 있는 접종 횟수가 필요하다. 접종을 1회와 2회로 나누어 실시하고 버퍼 pH를 6.9, 7.2, 7.5로 나누어 접종한 결과 1회 접종에 비하여 2회 접종 시 성공율이 높았다(Fig. 1). 접종 횟수는 작물 마다 달라지는데 고추에서 Tomato spotted wilt virus의 경우(Yang et al. 2012) 본엽에 1회, 멜론에서 Melon necrotic spot virus의 경우(Choi et al. 2010) 자엽과 본엽에 총 2회 접종하 기도 한다. 인산염 버퍼의 pH를 6.9, 7.2, 7.5로 달리 하였을 때 pH 6.9에서 접종 성공률이 높았다(Fig. 1). 바이러스의 접종은 여러 이온들과 pH에 영향을 받는데 이것은 세포막 표면을 침투하는 바이러스 입자의 전하에 영향을 미치기 때문이다(Motoyoshi and Oshima 1975). 일반적으로 약산성의 phosphate buffer를 이용할 때 바이러스 감염이 성공적이며 세포에 손상을 일으키지 않아 식물에서의 바이러스 접종 시 phosphate 버퍼를 이용하여 접종하고 있다(Motoyoshi and Oshima 1975).
나리 CMV 증상으로는 Kim et al.(2001)의 보고에서는 모자이크와 축엽증상이 관찰되었으며 신나팔나리에서 기계적 접종 시 잎에 황색 줄무늬가 길게 나타나거나 조직이 파괴되어 엽맥을 따라 괴사 증상이 나타났다고 보고 하였다(Chung et al. 2003). 본 실험에서는 바이러스 증상이 뚜렷이 나타나는 품종은 ‘Casa Blanca’, ‘Avocado’였으며 녹색이 옅어지고 미약하게 mottle 형태를 띠기도 하였다(Fig. 2A, 2F). Hypersensitive response(HR)는 빠른 programmed cell death로 식물의 병원체에 대한 저항성 기작으로 감염된 부위에 일어난다(Ehrefeld et al. 2005; Ren et al. 2006). 일반적인 HR 반응은 관찰 가능한 국부적인 괴사 증상으로 병반의 색은 노란색, 갈색 등을 띤다(Ehrefeld et al. 2005; Van Baarlen et al. 2004). Van Baarlen et al.(2004)이 Botrytis elliptica를 나리에 접종하였을 때 접종 후 4일 무렵에 노랗고 갈색의 HR반응이 나타났다고 하였다. 담배 잎에 Cauliflower mosaic virus를 감염시킬 경우 8 ~ 10일(Cole et al. 2001), 밀 잎에 Barley stripe mosaic virus genome을 접종할 경우 15일 경과 후에 HR반응이 관찰되었다(Whang et al. 2013). 증상과 발현 기간을 살필 때는 ‘Brunello’, ‘Rodrigo’ 품종과 ‘FA08-17’ 계통에서 15일 이내로 관찰 가능하였으므로 HR이라고 할 수 있으나(Fig. 2G, 2I, 2J). Cell death와 저항성은 독립적으로 일어날 수 있는 것이기 때문에 HR반응만으로 저항성을 확신하기에는 부족하다(Ehrefeld et al. 2005).
CMV를 검출할 수 있는 방법은 전자현미경을 이용하거나 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), Real time PCR, Enzyme Linked Immunosorbent Assay 등 다양하다(Lim et al. 2009). 본 실험에는 RT-PCR과 ELISA를 실시하였다. RT-PCR 실험결과 병징이 나타난 ‘Casa Blanca’, ‘Avocado’ 품종의 잎에서 바이러스가 검출되었다(Fig. 3A, 3F). ‘Brunello’, ‘Rodrigo’ 품종에서는 3반복 모두에서 바이러스가 검출되지 않았으나 ‘FA08-17’계통에서는 한 개체에서 바이러스가 검출되었다(Fig. 3 G, 3I, 3J). ‘Connecticut King’, ‘Mona’, ‘Party Diamond’, ‘Prato’, ‘Dublin’의 경우 병징이 나타나지 않았으나 RT-PCR 결과 바이러스가 감염된 것으로 확인되었다(Fig. 3B, 3C, 3D, 3E, 3H). 바이러스의 기관 간 이동에 대해 검토하기 위하여 구근에서의 바이러스를 검정하였을 때 ‘Connecticut King’과 ‘Casa Blanca’의 경우 일부 구근에서 바이러스가 검출되지 않은 것으로 나타났다(Fig. 3A, 3B).
ELISA 방식은 생육단계별, 식물 기관에 따라 바이러스 농도에 의존한다(Sharma et al. 2005). ELISA 검정 결과 병징이 없었던 ‘Mona’와 ‘Party Diamond’의 경우 농도가 높게 나타났으며 병징이 있었던 ‘Casa Blanca’의 경우 농도가 낮게 나타났다(Table 1). ‘Connecticut King’, ‘Prato’, ‘Casa Blanca’ 품종에서는 바이러스 농도가 낮게 나타났다. Kang et al.(2010)의 연구에서는 고추에 CMV 접종을 할 경우 저항성 품종의 경우 접종 부위에서는 바이러스 농도가 높았으나 상위 잎에서 낮은 특성을 보이는 경우를 보고하였으며, 이는 CMV 입자의 식물 기관간의 이동에 영향을 미치는 유전자에 의한 것이라 하였다. 이번 실험에서 잎과 구근에서 바이러스 ELISA 흡광도가 다르게 나와 영양번식성 작물이며 다년생 초본 작물인 나리가 바이러스에 감염됨에도 불구하고 영속적으로 재배될 수 있는 이유로 추측된다.
기존 보유 유전자원의 바이러스 이병율과도 함께 비교하였는데 ‘Connecticut King’, ‘Brunello’, ‘Casa Blanca’ 품종에서 대체적으로 CMV 이병율이 낮게 나타났으며 ‘Mona’, ‘Prato’, ‘Dublin’, ‘FA08-17’ 등에서 조사 개체에서 모두 CMV가 검출되었다(Table 2). 나리에서는 바이러스 저항성 유전자원 스크리닝을 위해 접종하여 실험한 것보다는 바이러스 자체의 병원성 특성에 대한 연구가 이루어져왔다. 품종에 대한 스크리닝은 농가 포장에서 발병률 조사 등에 의해 CMV 저항성으로 판단되는 품종들이 아시아틱 나리 ‘Prato’, ‘Novana’, ‘Brunello’ 등이 보고되었으며(Chinestra et al. 2010; Sharma et al. 2005) 국립원예특작과학원이 보유하고 있는 ‘Prato’와 ‘Brunello’에 대한 검정결과 ‘Brunello’는 저항성이 있는 것으로 확인되었다. 그러나 ‘Rodrigo’의 경우 생물검정 시 이병율이 낮았으나 포장점검 시 80% CMV에 감염되어 있는 것으로 나타나 경향이 다르게 나타났다(Fig. 3, Table 2).
잎과 구근에서 CMV검출이 다르게 나타남에 따라 나리에 있어 total RNA에 대해 2014년 NGS를 실시한 결과(Unpublished data)를 이용하여 상동성이 높은 유전자를 선별하였으며 Virus replication에 영향을 미쳐 바이러스 감염에 정의 영향을 미치는 TOM1(Yamanaka et al. 2000), Virus transport에 정의 영향을 미치는 OBE2(Hipper et al. 2013), R-gene 매개 이온 채널로 바이러스 감염에 부의 영향을 미치는 DND1(Jurkowski et al. 2004) 유전자의 발현을 검토하였다(Fig. 4). TOM1의 경우 대부분 품종에서 잎에서 발현되어 차이가 나타나지 않았으나 바이러스가 구근에서 검출된 ‘Connecticut King’과 ‘Party Diamond’, ‘Prato’ 품종에서 발현이 확연하게 나타났다(Fig. 4B, 4D, 4E), OBE2와 DND1 유전자 역시 대부분 품종에서 잎에서 발현되었으나 구근에서의 발현은 품종에서 잎에 비하여 모두 발현이 적은 것으로 나타났다. 품종 간의 차이점을 찾기는 어려워 다른 종류의 저항성 기작이나 유전자가 관여한 것으로 판단된다. 본 실험을 통해 얻어진 정보를 바탕으로 바이러스 저항성 후대 계통을 양성하고자 한다.
